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抗体的荧光标记法

基本原理
 
许多蛋白质分子在其表面含有较多的?#34507;?#37240;残基。这些?#34507;?#37240;残基的游离ε-氨基可与FITC(其激发波长为492nm, 发射光波长为525nm)共价结合。与FITC结合的抗体可用为特异性的探针,以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量(发射光与吸收光的比值,0 .85),而且形成的偶联物的稳定性很好。FITC是应用最广的荧光染料,流式细胞仪就按FITC的特性,设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm)。
偶联反应是在pH 9.8条件下,?#34507;?#37240;残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应,由此形成硫脲连接。
 
试剂及仪器
 
l         待偶联抗体
l         碳酸氢钠缓冲液:25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制,配法见附录)
l         PBS (见附录)
l         叠氮钠(有毒试剂)
l         异硫氰酸荧光素(I型异购体,有商品供应)
l         电磁搅拌器
l         铝铂
 
操作步骤
 
?#20445;?用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml,或抗体对该缓冲液充分透析,以足以使?#34507;?#37240;不解离(去其正电荷),但注意保持大部分蛋白质仍未变性;
2. 将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液(新配制)的烧杯中,用铝铂包烧杯以避光,4℃搅拌过夜;
3. ?#40092;?#25239;体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次,直致480nm 的吸收为零;
4. 加入0.5g/L 的叠氮钠。此后,结合物在4℃避光保存,或分装后在-20℃冻存。
 
荧光偶联质量的检测
 
用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。
或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定:
取结合物液0.2ml,加PBS 2.8ml(或两者均改用半量),测定其A490/A280,查 FITC标志曲线得其浓度μg/ml值,按IgG的消光系数(mg/ml约A280 1.2),可计算其F/P值,即每mg抗体所标记的μgFITC的比值,可以此鉴定?#27688;冉细?#25209;标记物的质量。
 
实验要点及?#24471;?br />  
?#20445;?nbsp; 偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行,而且注意在反应过程中要保持此pH水平;
2.  要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基(Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应,因此会降低蛋白质与FITC的偶联率);
3.  FITC与蛋白质的比值(F/P),可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为0.3-1.0(方法见前);
4.  FITC唯一的缺限?#19988;?#34987;光淬灭,因此复合物必须始终避光保存;
5.  如果FITC-复合物对PBS透析不充分,可能造成高本底,对免疫荧光染色产生干扰;
6.  如果被标记的蛋白质是第二抗体或通用的第一抗体,则?#30001;?#21697;购置可能更方便可取。

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