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免疫组化具体步骤中的一些问题

问:

我现在刚开始做石蜡切片免疫组化,具体操作过程中有些问题想要咨询一下
1.脱蜡至水:二甲苯I II 各10分钟后 100% 95% 85% 75%酒精各多久呢(因看各个版本的介绍都不同)
弱弱的问:只搞一个浓度的酒精如95%时间稍微长一些可以吗
2.抗原修复:可以枸橼酸加热至沸腾再放入切片保温5-10分钟吗?冷却至室温这步可以将切片拿出来冷吗?
3.加一?#36141;?7度2-3小时这步要怎么操作,切片怎样放在水浴箱呢?
4.DAB?#20204;?#20960;天的可以吗?一定要现用现配吗?
5.苏木精复染要几分钟呢?弱弱的问一下这步的作用是什么?
另外听说这步完了在透明之前要在稀盐酸中过一下有这种说法吗?作用是什么呢?

答:

1,以后各5分钟,最好是搞两个浓度的酒精,如95%,因为用久?#21496;?#20250;稀释.
2,我是这样做的:微波(MW)加热过程如下:在专用?#24515;?#25918;入200ml柠檬酸缓冲液(PH6.0±0.1),并盖上带有小孔的盖子,微波加热至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于?#36879;?#28201;塑料切片架中,放入已沸腾缓冲液中,采用微波炉中等功率800W,微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(建议用医用微波炉),中档继续处理10-20分钟;取出微波塑?#32454;?#20919;却至室温,从缓冲液中取出玻片,片子经蒸馏水冲洗二次,之后用PBS(PH7.2-7.4)冲洗两次,?#30475;?分钟。
经高温后冷却这一步不能省略.个人观点,15分钟的冷却是必须的:1、如这一步省略,对于有些抗体而言,会?#26723;虯R-IHC染色强度。2、突然从高温?#38477;?#28201;可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。(所以不要拿出来呀)
3,放入湿盒中.
4,DAB必须现用现配,并且配后30分钟内用完.
5,复染时间不等,有的30S,有的几分钟,根据组织,你自己多做?#21018;?#25720;索一下.作用是染细胞核.
另外,在透明之前是分化,用1%酒精盐酸,如果复染太深了,你可以分化,一般不用.
GOOD LUCK!

1)脱蜡的时候酒精的浓度要从高向低,我一般是二甲苯--二甲苯--100%酒精--100%酒精--95%酒精--80%酒精
2)抗原修复比?#29616;?#35201;,一般是在90度以上15分钟,先把片子放进去然后加热,15分钟后最好让其自然冷却,也可以将抗原修复的容器放在一盆冷水里,让其环境冷却后再将片子拿出来
3)我一般一抗孵育都是放在4度冰箱里过夜
4)DAB要现配现用,在30分钟内用完,我一般DAB显色30秒,效果还可以,但具体情况还是要具体分析,在显微镜下看情况而定,但是如果超过10分钟都没有颜色的话就说明染色失败了
5)苏木素是染细胞核的,我一般染1分钟,可以自?#22909;?#32034;一下
6)复染后可以用1%酒精盐酸分化,通过改变其PH值来分化胞浆的颜色。然后用淡氨水返蓝。
7)如果你的片子一直不出结果,先看看自己的操作有没有问题,二抗是不是针对一抗来源的特异性抗体,如果操作各步骤都没有问题,最先考虑的就是一抗的问题,你可以将你的免疫组化片子发来看看,大家一起?#33268;?#19968;下。

0512-62512025

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