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生物合成过程的标记

基本原理
 
对生物合成过程进行标记,主要是为?#25628;?#31350;蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程。通常将细胞放在含有充足营养成分和放射性标记氨基酸的培养基中,虽然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白质中的含量?#31995;停?#20294;其35S标记物具有特异性高(>2.93 ×1013 Bq/mmol) 、容易检测的特点,因此是进行生物合成标记的首选氨基酸。下列步骤是对悬浮液中细胞(脾或胸腺的单细胞悬浮液或者培养物)进行短期标记的方法。
 
 注意事项:
实验室应具备进行放射性化合物操作的各种相关设?#28014;?br /> 1. 放射性工作专用的水浴槽,保温箱和离心机;
2. 在进行标记操作的时候,用盖革氏计数器监测操作区域;
3. 做好35S 固体与液体废物的处理工作;
4. 在实验开始之前,要得?#36739;?#20851;部门的批准;操作中,要?#32454;?#22320;遵照国家管理条例的要求。
 
试剂与设备
 
l         在培养基中的细胞
l         冰冷却的 PBS (参见附录 A)
l         标记培养基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640 培养基,水浴预热到 37 ℃
l         [35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸(800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 ×1013 Bq/mmol)
l         15或 50 ml 锥形聚丙烯离心管
l         对标记培养基充分透析的胎牛血清(FCS)
l         L-谷氨酸.
l         微量吸管
l         恒温箱
l         离心机 (冷冻)
 
操作步骤
 
(一) 细胞的准备工作
1.       在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟,收集到 107-108 个细胞;
2.       在锥形离心管中,用10ml 37 ℃的标记培养基洗涤细胞,然后300 × g 离心5 分钟;
3.       丢弃上层清液;
4.       细胞沈淀加入标记培养基,重复洗涤一次。
 
(二) 前脉冲Prepulse
1.       洗涤后的细胞, 用37 ℃预热的标记培养基重新悬浮 (4 ml含 20 ×106个细胞) ,在37 ℃孵育 30分钟,间歇漩涡振荡,以耗尽细胞内原有的蛋氨酸和半胱氨酸;
2.       室温解冻[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸;
3.       注意: [35S] 蛋氨酸容易挥发,请在专用的、装有活性炭过滤器的通风橱内,打开[35S] 蛋氨酸储存液。目前,不易挥发的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸均有商品出售。
4.       细胞液在室温下, 以300 × g 离心5 分钟,弃上清。
 
(三) 脉冲Pulse
1.       将细胞团重新悬浮于标记培养基中 (浓度20 ×106个细胞/1 ml) ;
2.       加入 250 μCi 的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸 (9.25 ×109 Bq);
3.       细胞放入37 ℃恒温箱中,孵育30 分钟到 3 小?#20445;?#23413;育期间经常振荡,以保持细胞悬浮;
4.       细胞液在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟,弃上清;
5.       警告: 使用过的培养基和洗涤液均含有放射性,因此,请按规定方法操作和处理放射性物质;
6.       用10ml 冰冷的 PBS 重新悬浮细胞,反复洗涤两次;
7.       按“细胞提取液的制?#28014;保?#35265;Protocol 43)中的方法进行细胞处理和分析,或者-20 ℃冻存细胞。
 
 
质量要点
 
1.       如果脉冲需要?#20013;?小时以上,需要在无菌的条件下,向标记培养基中添加2% 的胎牛血清和2%的 L-谷氨酸;
2.       对于大多数类型的细胞,可以采用带螺口的组织培养瓶,并在湿润的、含5% CO2的培养箱中进行孵育;
3.       孵育必须在37 ℃进行,温度低会显著地减少掺入到蛋白质中的放射性;
4.       ?#37096;?#20197;使用14C-标记的氨基酸作标记,其半衰期长,有利于在较长的时间(几个星期)内使用标记的蛋白质,  例如标记杂交瘤B细胞分泌的单克隆?#22266;澹?#23601;常采用14C-标记的氨基酸混合物(丝氨酸,亮氨酸,缬氨酸)。

0512-62512025

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