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免疫胶体金标记抗体及检测抗原

基本原理
 
胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物,可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定,但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金,可作标记二抗进行免疫检测,本方法应用范围广,染色后的样品可以长期保存。
 
试剂和设备
l         超速离心机
l         显微镜
l         温箱
l         分光光度计
l         0.2 um 微孔滤膜
l         载玻片,盖薄片,滤纸
l         氯金酸钠
l         1% 柠檬酸钠水溶液
l         山羊抗鼠Ig抗体
l         对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体
l         自人外周血分离的白细胞悬液
l         10%氯化钠
l         1% 聚乙二醇
l         0.01mol/L pH7.2的PBS
l         1% 戊二醛乙醇溶液
l         50%硝酸银溶液(提前一天配制)
l         明胶显影液,2g明胶溶解于99ml蒸馏水中,加1 ml甲酸
 
操作步骤
 
(一) 胶体金溶液制备
1.称取0.1g 氯金酸钠,溶解于1L去离子水中;
2.加热煮沸,剧烈搅拌下,迅速加入25ml新配的1%柠檬酸钠溶液;
3.继续煮沸5分钟,至溶液变?#23665;?#32418;色;
4.用蒸馏水将溶液的525 nm波长下的光密度吸收值调到 0.8。
(二) 胶体金的包被
1.  将山羊抗鼠Ig抗体以 36 900 ′g 离心30分钟;
2.  上清液经0.2 nm 滤膜过滤;
3.  确定蛋白质包被的最佳浓度:将蛋白?#39318;?#36830;续10倍稀释各1ml,加入5ml胶体金溶液,1分钟后加入1ml 10%氯化钠溶液,静止5分钟;以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度,选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被。
4.  取50ml胶体金溶液,用0.2M K2CO3调pH值为7.6,按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合,让蛋白质吸附2分钟后,加0.5ml 1%聚乙二醇,防止非特异性凝集;
5.  5000′g 离心1小?#20445;?#24323;上清液,将胶体金悬浮于含 1% 聚乙二醇的 PBS中;重复一次;
6.  弃去上清液,将包被的胶体金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀释, 经微孔滤膜过滤后,4℃保存。
(三) 抗原检测
1.  取20ul人外周血白细胞与5ml T淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟;
2.  1000 r/分离心清洗细胞5分钟,2次;
3.  将洗涤后?#21335;?#32990;与20ml(一般效价1:20)胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟;
4.  1000 r/分离心清洗细胞5分钟,2次;
5.  将细胞涂片于载玻片,用1% 戊二醛固定细胞10分钟,清洗多余固定液;
6.  将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中,加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液,覆以盖玻片,放入60-65℃的温箱中,显色3-4分钟,直至玻片标本呈现金褐色为止;
7.  移出盖玻片,用蒸馏水迅速漂洗数秒,晾干;
8.  光学显微镜下观察。
 
对照试验
 
  可以用?#37255;?#19968;抗?#21335;?#32990;作为对照试验组。
 
试验要点及说明
 
1.  所使用的器皿均应非常洁净,需经过硅烷化处理;
2.  使用高纯度多次蒸馏去离子水;
3.  胶体金颗粒的形成、大小和速度,均决定胶体溶液的稳定性,水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要,本过程制备的胶体金颗粒?#26412;对?#20026;18-20 nm;
4.  因为胶体金在电解质中不稳定,本实验全部操作过程要?#32454;瘛?#36805;速,注意液体颜色;
5.  蛋白质包被胶体金时?#21335;?#23545;最佳浓度要事先测定,测定最佳浓度?#20445;?#33014;体金溶液的pH值也要调节到pH7.6;
6.  一抗和胶体金标记二抗?#21335;?#37322;浓度应事?#26579;?#39044;试验以最佳效价。

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